《AM》：3D打印可食用支架用于干细胞培养，以后不缺肉吃了！

 

转载  原创 EFL EngineeringForLife 2022-11-11 00:00 发表于江苏  如有侵权，请联系。

 

从肌肉干细胞体外培养肉需要3D可食用支架作为支持基质。电流体动力(EHD)打印是一种新兴的3D打印技术，用于制造用于生物医学应用的具有高精度微结构的超细纤维支架。然而，可食用的EHD打印支架在养殖肉类生产中仍然稀缺，部分原因是对墨水的可打印性有特殊要求。

 

 

在这项工作中，来自新加坡国立大学苏州研究所的Linzhi Jing和黄德建研究员团队将从大麦或黑麦中提取的谷类醇溶蛋白与玉米醇溶蛋白混合，以产生纯醇溶蛋白基墨水，表现出与普通聚己内酯(PCL)墨水相似的良好印刷性。优化条件后，成功制备了具有高度有序镶嵌结构的玉米蛋白/大麦醇溶蛋白和玉米蛋白/玉米醇溶蛋白支架。由于多孔纤维表面，醇溶蛋白支架表现出良好的水稳定性和体外降解性。此外，小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12)和猪骨骼肌卫星细胞(PSCs)可以在纤维基质上粘附和增殖，并且通过在具有高组织相似性的醇溶蛋白支架上培养PSCs产生培养肉片。肌原蛋白的上调表明分化过程在3D培养中被触发，证明了醇溶蛋白支架在培养肉生产中的巨大潜力（图1）。相关论文“3D-Printed Prolamin Scaffolds for Cell-based Meat Culture”于2022年10月22日发表于杂志Advanced Materials上。

 

 

 

图1 基于通过电流体动力印刷的醇溶蛋白支架的培养肉模型示意图

 

 

1. 玉米蛋白/大麦醇溶蛋白和玉米蛋白/玉米醇溶蛋白支架的表征

 

首先，研究者将醇溶谷蛋白纤维制成具有正方形孔形状和400微米孔径的多层开孔支架(图2A)。图2(B-E)中显示的SEM表明，印刷的醇溶谷蛋白纤维的直径约为20 μm，纤维以有序的方式逐层堆叠，平均纤维高度为7–10 μm。两个平行纤维之间的距离称为孔径，为400 μm。由于超细纤维和高度有序的开孔结构，打印支架的孔隙率高达88%，为细胞增殖提供了充足的空间，有利于营养和废物交换。此外，与PCL支架相比，在醇溶蛋白纤维中发现了更一致的高度(图2F，由箭头指示)，其中在交叉处观察到明显的凹形纤维堆叠，揭示了基于蛋白质的墨水可以更好的固化。印刷的醇溶谷蛋白支架可以吸收水并在水溶液中膨胀。醇溶蛋白基支架的重量几乎是其原始重量的两倍，在37 ℃下浸泡在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中24小时后，纤维宽度增加了40%，而PCL支架由于其疏水性几乎没有观察到变化(图1G-H)。

 

 

 

图2 玉米蛋白/大麦醇溶蛋白和玉米蛋白/玉米醇溶蛋白支架的表征

 

 

2. 哺乳动物骨骼肌干细胞在醇溶蛋白支架上的细胞行为

 

为了理解细胞行为和开发基于可食用醇溶蛋白支架的养殖肉（CM）模型，研究者将C2C12成肌细胞和PSCs接种在支架上。如图3A和B所示，C2C12和PSCs都广泛增殖，细胞数量在第11天达到最大值。荧光染色后，研究者观察了在玉米蛋白/大麦醇溶蛋白和玉米蛋白/玉米醇溶蛋白支架上生长的细胞的形态(图3C和D)。最初，骨骼肌细胞附着在纤维表面，并沿着纤维生长，在支架的孔隙中形成一个圆形。这是因为醇溶谷蛋白纤维的高曲率阻止了细胞突起在整个纤维表面上的扩散，并迫使它们沿纤维的径向排列。如图3E所示，细胞在培养板上呈扁平星形，长度为40微米-80微米，宽度为20微米，因为它们只能附着在平面基底上。相比之下，肌细胞在3D支架上表现出细长的纺锤状形态，它们可以在纤维表面和孔隙空间增殖，形成高密度的组织结构。

 

 

 

图3 哺乳动物骨骼肌干细胞在醇溶蛋白支架上的细胞行为

 

 

3. 粘附基因和肌生成蛋白的表达

 

为了进一步阐明细胞-支架在粘附、增殖、分化和成熟方面的相互作用，使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法评估了相关关键生物标志物的基因/蛋白质表达水平。对于C2C12，整合素β1和N-钙粘蛋白在玉米蛋白/大麦醇溶蛋白和玉米蛋白/玉米醇溶蛋白支架上的表达水平显著高于在2D细胞培养板上的表达水平(图4A)。这些结果表明，醇溶蛋白支架可以刺激C2C12表达相关基因/蛋白质，从而支持细胞附着。在三维培养模式中发现了更强的细胞间相互作用，这与CLSM的结果一致。此外，PSCs在支架上表达整合素α5和β1的水平与在2D平板上相当(图4B)，表明醇溶蛋白支架具有令人满意的生物相容性。图4C表明，结蛋白、MYOG和MYHC的蛋白表达水平在血清饥饿7天后显著增强。此外，观察到PSCs的MYOD表达水平在醇溶蛋白支架上显著增加(图4D)。

 

 

 

图4 粘附基因和肌生成蛋白的表达

 

 

4. 养殖肉模型的评估

 

适当的机械强度支持细胞生长是至关重要的。如图5A所示，虽然溶胀后形态略有变化，但在培养基中浸泡7天后，所开发的醇溶蛋白支架没有塌陷，证明了其良好的结构稳定性。如图5B-D SEM图像所示，培养肌细胞几天后，纤维表面出现大量孔隙。为了证明在醇溶蛋白支架上开发CM的概念，通过在玉米蛋白/玉米朊支架上培养PSCs，然后进行分化来制作肉片，并使用甜菜提取物作为食品着色剂来构建红色培养肉模型(图5E和F)。肉片在颜色和质地方面具有与真肉相似的外观，与接种前支架的原始尺寸相比减少了约28.6%。此外，由于平台中使用的支架是可食用的醇溶谷蛋白，因此不需要额外的步骤来去除支持基质。这些结果进一步证实了所提出的基于醇溶蛋白的支架在培养肉生产中的巨大潜力。

 

 

 

图5 养殖肉模型的评估

 

 
综上，本文首次使用谷物醇溶蛋白配制纯蛋白墨水，包括分别从大麦和黑麦面粉中提取的玉米醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白，通过EHDP技术制造完全可食用的纤维支架。细胞培养结果表明，C2C12和PSCs可以有效地粘附、增殖、分化，并融合到醇溶蛋白支架上的组织结构中，正如细胞粘附相关基因的上调和肌肉组织特异性蛋白的表达所证明的那样。在食物功能化后，通过在醇溶蛋白支架上培养PSCs 12天产生培养切片。尽管少数消费者可能由于耐消化性而对谷物蛋白过敏，但开发的醇溶谷蛋白支架显示出许多优点，(i)廉价且易得的具有可食用性和可印刷性的支架生物材料；(ii)纤维结构在细胞培养系统中保持良好，无需额外的交联方法来增加植物蛋白的稳定性；(iii)良好的细胞相容性，以支持肌肉细胞的生长和成熟。总的来说，本发明的可食用醇溶谷蛋白支架展示了作为用于高质量CM生产的新型3D基质的巨大潜力和商业价值。EHDP装置的技术进步应该促进支架的大规模制造，从而加速使用这种方法的养殖肉生产的商业化。

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