东南大学生物科学与医学工程学院：仿生细胞膜拮抗联合纳米酶协同治疗急性髓系白血病 Bioactive Materials
转载原创 BioactMater生物活性材料 2022-12-20 17:30 发表于河南 如有侵权，请联系。
近期，东南大学生物科学与医学工程学院顾宁院士、张宇教授在科爱出版创办的期刊 Bioactive Materials 上发表文章：仿生细胞膜拮抗联合纳米酶协同治疗急性髓系白血病。基于复合纳米酶的级联催化治疗功能，并结合靶向 CXCR4/CXCL12 生物轴的拮抗治疗，构建了一种在血液循环中具有“隐身”功能的细胞膜仿生纳米酶载药系统（PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM），以期实现对急性髓系白血病的靶向多机制协同增效治疗。
01 研究内容简介
该细胞膜仿生纳米酶载药系统采用生物相容性高分子聚乳酸-羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）包裹全氟溴辛烷（Perfluorooctylbromide, PFOB）作为供氧内核，在其表面偶联具有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶活性的超小Pt纳米颗粒，然后利用负载阿霉素（doxorubicin, DOX）的小鼠骨髓基质细胞膜进行包覆。如图 2 所示，在 PLGA纳米颗粒表面沉积了大量的Pt纳米团簇，并且在PFOB@PLGA@Pt 微球表面观察到一层清晰的细胞膜壳层。电泳实验证明MS-5细胞、MS-5细胞膜和 PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM仿生纳米颗粒均表达CXCL12蛋白，并且具有高度一致性，说明CXCL12在MS-5细胞膜表面过表达。
图1. 细胞膜仿生纳米酶载药系统的制备及其提高抗AML疗效的示意图。
该细胞膜仿生纳米酶载药系统采用生物相容性高分子聚乳酸-羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）包裹全氟溴辛烷（Perfluorooctylbromide, PFOB）作为供氧内核，在其表面偶联具有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶活性的超小Pt纳米颗粒，然后利用负载阿霉素（doxorubicin, DOX）的小鼠骨髓基质细胞膜进行包覆。如图 2 所示，在 PLGA纳米颗粒表面沉积了大量的Pt纳米团簇，并且在PFOB@PLGA@Pt 微球表面观察到一层清晰的细胞膜壳层。电泳实验证明MS-5细胞、MS-5细胞膜和 PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM仿生纳米颗粒均表达CXCL12蛋白，并且具有高度一致性，说明CXCL12在MS-5细胞膜表面过表达。
图2. 细胞膜仿生纳米酶载药系统的表征图。(a) PFOB@PLGA磷钨酸染色图像及相应的EDS元素映射图像；(b) PFOB@PLGA@Pt磷钨酸染色图像和元素映射图像；(c) PFOB@PLGA@Pt@CM磷钨酸染色图像；(d) PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM制备过程中流体力学尺寸；(e) PFOB@PLGA@Pt@CM制备过程中的Zeta电位变化；(f) MS-5细胞、MS-5细胞膜囊泡和PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM纳米复合物的Western blot分析。
图3. 细胞膜仿生纳米酶载药系统的。(a) 携氧能力；(b) 葡萄糖氧化酶活性；(c) 过氧化物酶活性；(d-e) ·OH 的形成验证。
PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM装载了大量的PFOB使其具有较强的载氧功能（图3a）， 可以发挥葡萄糖氧化酶活性催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和 H2O2（图3b），同时进一步模拟类过氧化物酶活性（图3c），催化形成的H2O2转化为高毒性•OH（图3d-e）。
图4. 细胞膜仿生纳米酶载药系统的细胞内摄取及ROS产生能力。
PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 通过MS-5细胞膜的特异性识别并靶向白血病细胞，被内吞进入细胞并定位于细胞溶酶体内（图4a-c），经过级联催化反应，诱导细胞内产生大量的ROS（图4e）。
化疗药物可以在细胞外水平从细胞膜仿生纳米酶载药系统中缓慢的释放，有助于实现 AML治疗的有效药物传递（图5a）。PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 在细胞水平有效地阻断了 CXCR12 诱导的白血病细胞向骨髓的迁移和粘附行为（图5b-c），能够有效抑制白血病细胞增殖（PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM组48 h细胞活力明显降低至12.7±2.6%），促进了对AML细胞的杀伤作用（图5d）。
图5. （a）药物从细胞膜仿生纳米酶载药系统的体外释放曲线（n=3）；(b) 细胞膜仿生纳米酶载药系统抑制 CXCR12 诱导的 HL-60 细胞迁移；(c) 细胞膜仿生纳米酶载药系统对 HL-60 细胞向 MS-5 细胞粘附的抑制作用；(d) CCK-8 法和LDH 法测定 HL-60 细胞的活力。
图 6.（a）小鼠骨骨髓组织的荧光图像；（b）体内各组织器官的荧光图像；（c）细胞膜仿生纳米酶载药系统的处理小鼠10 h、20 h、30 h的荧光图像；（d）静脉注射PFOB@PLGA@Pt和细胞膜仿生纳米酶载药系统的血液清除率曲线（n=3）；（e）AML 小鼠主要脏器中 Pt 含量的分布。
PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 的血液半衰期约为 17.8±2.6 h（图6d）, 这与细胞膜在血液循环中的隐身作用有关，更长血液循环的PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 能够有效地消除血液和骨髓中的 AML 细胞（图6c）。基质细胞膜的粘附特性使仿生纳米载药系统能够精准到达骨髓并有效清除骨髓中残留的白血病细胞（图6a）。细胞膜仿生纳米载药系统主要通过肝脏、脾脏代谢，并且这些代谢到肝脾的纳米颗粒也可以进一步杀死浸润到肝脏和脾脏中的 AML 细胞（图6b、6e）
图7. 细胞膜仿生纳米酶载药系统的体内治疗效果：(a) 各组AML小鼠骨髓、脾脏和外周血HL-60细胞百分比；(b)小鼠的生存曲线(n=6)；(c) AML小鼠的相对体重变化(n=6)；(d)不同处理的小鼠脾脏形态(n=4)；(e)治疗后脾脏重量；(f)肝脏和脾脏的H&E及免疫组化分析(CD33阳性细胞)。
PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 能明显降低外周血、脾脏、骨髓中白血病细胞数量, 与对照组相比，PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 组骨髓中 HL-60 细胞比例由 75.6%降至 7.7%，脾脏中 HL-60 细胞比例由45.6% 降至 2.8%，外周血中 HL-60 细胞比例由51.6%降至 2.4%（图7a）。PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM 能显著延长AML小鼠的生存期，PFOB@PLGA@Pt@DOX-CM组小鼠存活时间约为 67 天，然而生理盐水和 DOX 组的小鼠存活时间小于 45 天（图7b）。细胞膜仿生纳米载药系统显著阻断了 AML 细胞向脾脏和肝脏的浸润，降低了白血病小鼠的疾病症状，有效地增强了治疗效果（图7d-f）。
总之，本研究成功制备了细胞膜仿生纳米载药系统，具有较强的载氧功能、较高的酶催化活性、精准的靶向性、良好的药物释放性能，在体外能显著地降低白血病细胞活性。在MS-5细胞膜的准确引导下，细胞膜仿生纳米载药系统在体内靶向并进入AML细胞，缓慢释放Pt纳米酶、PFOB和DOX。在弱酸性溶酶体环境中，具有促氧化活性的Pt触发级联催化反应，产生大量的•OH，与DOX协同增效杀死白血病细胞。基质细胞膜的粘附特性使仿生纳米载药系统能够精准到达骨髓并有效清除骨髓中残留的白血病细胞。仿生细胞膜还起到了CXCR4拮抗作用，阻断CXCR4/CXCL12介导的白血病细胞向肝脏、脾脏等器官的浸润，防止AML细胞返回骨髓。这种仿生细胞膜纳米酶递药系统具有靶向、拮抗、联合治疗多种功能，为难治性白血病的抗耐药复发治疗提供了新思路。
