述评|生物3D打印在器官再造中的前沿热点和研究进展

       生物3D打印是采用生物材料和生物活性成分制作人工组织器官的新兴制造技术，已在多个医学领域广泛应用，在器官再造领域也具有突出的优势。近年来，生物3D打印器官取得了一系列重要突破，但目前仍处在研发和探索阶段，存在较多瓶颈，尚还不能用于体内移植。本文主要就3D打印技术的医学应用，生物3D打印技术的特点，生物3D打印器官在仿生结构、功能重建、免疫反应等方面的研究热点和难点，以及生物3D打印的最新研究进展，阐述生物3D打印技术在器官再造领域的应用前景，为器官重建、人工器官构建的研究及其临床应用提供新思路，以推动器官移植和个性化医疗的发展。

      3D打印技术诞生于20世纪80年代，最早称为快速成型技术，现归类为增材制造技术。3D打印技术发展至今已衍生出多种打印工艺，并扩展至众多行业领域，产生了重要的应用价值。目前3D打印技术在医学领域多个方面的应用已经日趋成熟，但在再生医学、器官移植方面的应用仍处于研发和探索阶段，距离实际临床应用还有一段距离[1-3]。本文就生物3D打印技术在器官再造领域的前沿动态、热点和难点进行介绍。

3D打印技术是一种制造技术，基于三维数字模型切片后的路径规划参数，采用可粘合材料通过3D打印机按规划路径进行逐层打印，制造出立体产品。3D打印设备的种类通常基于不同的3D打印工艺进行划分，最初问世的3D打印工艺是光固化立体成型（stereolithography，SLA），通过紫外光诱导光敏树脂交联进行逐层打印，而后选择性激光烧结（selective laser sintering，SLS）、立体喷墨打印（3D printing，3DP）、熔融沉积成型（fused deposition modelling，FDM）、数字光处理（digital optical processing，DLP）等多种工艺陆续问世[4-7]。

模型、器械3D打印的临床应用已较为成熟。基于影像数据重建后的三维数字模型可以作为打印和计算机辅助设计的模板，为3D打印的医学应用提供了技术基础[8]。3D打印的医学应用最早是制作病例模型、手术导板，之后扩展至个性化康复支具的制造，多基于FDM和SLA工艺，采用人工高分子材料进行制作[4, 7]。类似应用已经较为成熟，部分3D打印服务和产品也已纳入医保。近年来，3D打印的钛合金材质三类医疗器械也陆续问世并投入生产，且随着个性化定制医疗器械的相关产品标准逐步完善，该领域的临床应用将不断增多[9]。

具有生物活性的植入物是当下3D打印研究领域的热点。利用3D打印技术制造人工组织可以修复组织创伤、重建组织功能，但目前多处于实验室研究阶段，少数研究进展到了临床试验阶段。在目前的研究阶段，通常将生物材料、干细胞、生长因子复合制成组织工程化制品[10]，3D打印技术在其中的作用是作为构建个性化仿生结构的制造技术。目前细胞和生物活性成分与生物材料的结合方式包括表面黏附和内部包载，早期因打印工艺和设备的缺乏，应用较广泛的是表面黏附，采用热塑性的高分子材料如聚乳酸、聚己内酯等，通过FDM工艺制作成多孔支架，再经支架或细胞共培养促进细胞和生长因子黏附，用于组织移植修复。近年来，随着对细胞无损的直写成型、DLP等工艺的3D打印设备普及，采用水凝胶包载细胞进行生物3D打印成为新的研发热点，可在保证细胞存活率的同时简化共培养步骤，提供更贴近组织生长速率的材料降解速度[2, 11]。除此之外，也有研究者尝试直接在组织损伤创面上进行原位生物3D打印修复[12]。

3D打印技术在器官再造领域的未来发展目标是完全采用细胞成分进行3D打印，构建形态仿生、功能仿生的人工器官，并向多器官再造方向发展。器官是由多种不同类型组织发育分化并且互相结合构成，具有特定的形态和生理功能，生物3D打印从组织打印向器官打印过渡仍需一段时间的发展及基础研究领域的不断深入。

生物3D打印经过最近十年的迅猛发展，取得了众多里程碑式的成果。作为生物3D打印概念的早期验证，人耳廓形态软骨裸鼠模型早在1997年已被提出。上海交通大学曹谊林教授成功为5例患有先天性小耳畸形的儿童移植了定制化打印的耳状软骨，经过两年半的随访，3D打印耳形态与正常耳基本一致[13]。这项临床试验研究成功在体外培养人耳状软骨并进行移植，彰显了3D打印器官未来应用的巨大潜力。

相较于3D打印硬组织已经快速地应用于临床治疗中，3D打印软组织器官的发展则较为曲折，真正的人体器官是由多种不同细胞及细胞亚群组成，器官中除了功能细胞还具有大量的血管、神经等结构。因此，多组织协同打印是目前实现器官复杂功能的一种策略。在生物3D打印人工器官的血管网络构建方面，美国Organovo公司研究人员打印了肝脏细胞与血管内皮细胞逐层交替的微型肝脏补片，其微血管吻合良好，血液可以从周围的肝脏组织运输到肝脏补片中，维持3D打印器官的功能，这项研究标志着移植3D打印器官促进血管再生吻合的可能性。

生物3D打印人工器官的形态仿生方面近年来取得重要进展。Noor等[14]采用来源于患者脂肪组织干细胞构建的诱导多能干细胞，混合细胞外基质、胶原蛋白等成分制成生物墨水，构建出具有心房、心室、主要血管的微型心脏。因为生物墨水主要成分来源于患者自体细胞，该人工器官可以匹配患者自身的免疫、细胞、生化特征。

生物3D打印人工器官的功能仿生同样取得重要突破。在心脏的生物3D打印方面，Jallerat等[15]构建了一种打印胶原蛋白内外壁，中间打印心肌细胞的新型生物3D打印方式，构建了左心室和心脏瓣膜模型，经过体外培养后，该组织模型可以产生自发搏动功能。在肺泡的生物3D打印方面，Grigoryan等[16]构建了具有与人体血管、气管结构相同的网络结构的3D打印肺，能够像正常肺部一样输送氧气，进行“呼吸”这一生理过程。

面对近年来新型冠状病毒（SARS-CoV2）肺炎疫情的爆发，对于免疫系统的3D打印器官的研究也逐步加快。Ramaswamy等[17]团队合成了一个完整的功能性免疫系统，其构建的3D打印淋巴结具有完整的合成系统，可以迅速产生大量SARS-CoV2抗体，应对病毒感染。

目前器官再造的生物3D打印已经从单一成分打印向多种成分打印发展；从单一组织向多组织协同打印发展；从无响应性向刺激响应性发展。目前的生物3D打印在器官再造领域中，正从组织打印向类器官打印方向迈进，未来将进一步向完整器官打印迈进。回顾近年来的每一次3D打印器官技术的突破，我们有理由相信3D打印器官距离移植到人体已经不再遥远。

生物3D打印相关研究在最近十年迎来迅猛增长。2015年之前，3D打印相关的研究论文发表数量为2 400余篇，2015年至2021年，发文量上升至近16 000篇，并且呈现出与材料科学、纳米科学、放射学核医学、生物技术应用等多学科的交叉融合[18]。在转化应用方面，生物3D打印的多家知名设备公司和打印服务供应商都在积极布局生物3D打印设备与组织器官再造的研究，市场规模的年复合增长率 > 20%，已有多项3D打印组织工程制品临床研究正在进行。

科研领域和产业领域都将生物3D打印技术视为器官再造的重要技术手段，得益于技术本身的工艺和原理[19]。首先，分层打印、逐层叠加的工艺特点使3D打印技术易于构建三维立体结构。在细胞层面上，3D打印提供的三维培养环境较培养皿中的二维培养方式要更加接近体内的立体环境，细胞在体外培养如果缺乏空间上的细胞间和细胞与基质间相互作用，其细胞表型、增殖分化活动、代谢活动将与体内培养环境存在巨大差异[20]。

其次，三维数字模型等比例重建和设计修改便捷特点使3D打印技术易于进行个性化定制。3D打印技术在设计、打印、后处理等环节的可操控性高，适合进行少量产品的定制生产。因此，以缺损组织或损伤器官的形态作为打印模板，采用来源于患者的细胞进行生物3D打印，有望获得精准匹配且无免疫原性的人工器官[21]。

再者，对细胞无损、多材料、多通道的生物3D打印有望实现多组织器官的构建。组织层面上，器官中特定组织的特异性分布是器官发挥生理学功能的先决条件，3D打印可控的立体结构制造恰好为多组织构建提供了可能。目前的生物3D打印机多采用气压或机械驱动的直写成型式打印工艺，避免了长时间紫外光交联、高温熔融、激光熔融等会引起生物活性成分失活的工艺技术。现有的生物3D打印设备已经可以实现打印后细胞存活率 > 90%，并能适配多料仓、多材料打印方式。随着工艺技术的开发，有望实现组织层次的精确构建[22]。除此之外，利用可提取或合成的生物材料，以及可培养扩增的细胞作为原料进行3D打印，极大程度解决了器官移植的供者来源、供者配型及排斥反应问题[23]。

近年来，3D打印技术与其他技术的交叉融合也产生出多种新型设备、新兴应用。如静电纺丝技术结合生物3D打印技术用于构建微纳米表面的组织修复支架，提高支架仿生程度和生物相容性；载细胞可注射微球结合生物3D打印技术形成高细胞载量、模块化的生物墨水，用于制备功能化组织修复支架等。在器官再造方面，随着对器官发育复杂调控基础研究的不断深入，催生出对类器官模型、器官芯片技术、生物3D打印技术相结合的前沿研究方向。

随着微流控芯片技术的不断发展，在芯片上构建仿生微器官来替代生物体研究和进行药物评估等已成为构建未来新药评价体系的重要发展趋势。将3D打印技术在微组织构建和器官再造等方面的独特优势与微流控芯片技术整合，从而实现对器官疾病机制的研究和相关药物的开发与评估，是当前生物医学领域研究中的一个重要方向[24]。器官芯片与传统培养方式最大的不同在于其动态灌注的特性。

Zohar等[25]利用其团队设计的高通量血管工程芯片，研究了液体灌注环境对于上皮细胞迁移和血管网络生成之间的关系，发现在适宜的灌注条件下，血管的生成速度是静止条件下的两倍，证明了器官模型培养中动态灌注条件的重要性。器官芯片另一个优势在于芯片结构的设计可以精细到微米，以满足某些细胞的特殊需求。Yamamoto等[26]利用3D打印制备了相互分离的双腔培养体系（分为神经培养腔和肌肉培养腔）和连接双腔的微米级流道，通过精密控制的微小流道，引导神经轴突从神经培养腔长入肌肉培养腔，组成一个微小的神经肌肉单元。由于神经、肌肉独立培养，解决了传统肌肉神经共培养下难以分开控制的缺点，证实了该微小神经肌肉接头单元有望实现重症肌无力相关的药物测试，为药物筛选开辟了新的途径。Lind等[27]利用3D打印技术，以多种材料混合作为墨水，通过巧妙的设计在芯片内构建了电阻传感器，可根据电阻的变化推算心肌组织的收缩力，并用一种简单的、可视化的、非侵入性的方式持续采集心肌组织的数据，该芯片可以用于心肌类药物药效的研究。

器官芯片发展迅速，凭借微流控平台高精度、动态灌注、体积微小、高通量的特点，为类器官的培养提供了良好的条件，3D打印加持下的芯片流道设计也可以做到更加精巧。但作为器官芯片主体的“器官”部分却还停留在2D或2.5D阶段，大部分器官芯片只能做到单层的细胞培养。如何重现天然复杂的三维器官结构仍是制约器官芯片发展的关键因素，而立体三维结构的构造恰好是生物3D打印技术的优势，相信随着生物3D打印技术的发展，问题也将迎刃而解。

以往有关生物3D打印器官的研究被大量报道，但尚未能构建出可进行体内移植的人工器官，其涉及材料、细胞、微环境、3D打印结构等多个方面，以下简要总结生物3D打印在人工器官构建中的难点问题和重点问题。

生物3D打印器官的生理功能与其三维结构密切相关，该三维结构需要从3个方面与人体组织进行匹配：（1）厘米尺度上人工器官的形态需要与解剖学形态匹配；（2）微米尺度上人工器官的多孔结构需要与组织、细胞生长需求匹配；（3）亚微米尺度上人工器官的材料表面形貌需要与细胞生长、分化需求匹配。前两者可以通过3D打印切片程序进行调控，后者需要结合工艺制备技术实现。

微米尺度的多孔结构方面，生物3D打印研究最常用的三维结构是0°和90°交替排列的“田字形”网格结构，该结构打印的路径规划简单、成型难度低，可有效为细胞提供黏附生长空间，为物质交换提供连通的孔道，为组织长入提供空间。但随着研究深入，蜂窝状多孔结构、松质骨仿生结构等被陆续提出，并证实特定的仿生结构，在支架表面积、营养物质交换率、生物力学性质上可能优于网格结构[28]。

亚微米尺度的材料表面形貌特征对细胞黏附、生长、分化具有重要影响。3D打印与静电纺丝、相分离、微图案化等技术方法相结合，可以在3D打印的微米级多孔结构基础上，添加亚微米或纳米级的纤维纹理。一方面，可促进细胞的定向排列生长，从而实现组织各向异性的仿生诱导，构建出器官的组织仿生层次[29]；另一方面，亚微米尺度的纤维纹理可引起细胞骨架、整合素重排，影响细胞的黏附、迁移，以及某些特定的定向分化功能。在功能仿生方面，也有仿生分层结构模拟自然界超疏水表面和不同颜色偏振的应用，实现变色和光学传感功能；仿生结构结合响应性材料，可构建条件响应的功能化器官[30]。

仿生结构不是单纯意义上对天然器官形态的仿生模拟，而是对器官功能构建相关结构特征的仿生。仿生结构的探索需要充分结合体内外研究，筛选适宜器官再造的结构参数条件，如对细胞分化有利的微孔形状、对营养物质交换有利的孔隙率等。

生物3D打印器官的构建难点，在于维持人工器官的存活和运作。为了维持人工器官的生物活性，需要实现器官的氧气和营养物质交换功能，因此血管化必不可少。有研究对多层组织进行培养，发现如果组织结构的厚度 > 500 μm，则无法通过单纯的物质扩散来为细胞供给营养，需要血管网络[31]。以往的研究工作发现，体内环境会诱发血管新生长入移植的人工组织中，但其生长速率和血管网络形态是不可控且不理想的[32]。相比较下，来源于供者的移植器官由于保留了血管组织，血管吻合后即可恢复血供，体现出构建的人工器官和天然器官在形态和功能上仍存在较大差距。目前，已有多种方法可实现生物3D打印器官的血管化：（1）3D打印牺牲材料预留血管通道[33]。在人工器官制备时去除牺牲材料从而预留出血管通道，并采用共培养或灌注培养的方法诱导内皮细胞形成血管样组织，该方法有效建立了气管内部的血管网络，但对于复杂走形和细末分支的血管构建存在困难。（2）同轴3D打印制作中空结构血管样通道[31]。同轴打印可构建核、壳层结构两种材料，或是内层中空的结构，该方法构建的器官血管网络分布广泛且均匀，但对于血管分支构建存在困难。（3）体外及体内的预血管化培养[34]。打印完成的人工器官，在灌流装置中诱导内皮细胞形成血管网络，或是暂时移植于受体皮下进行血管化诱导。（4）生物因素调控血管新生。在生物墨水体系中加入血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），促进血管生成。上述生物3D打印器官血管化策略旨在通过血管网络的构建提高人工器官的生物活性，维持其存活，但对于器官移植手术的血管吻合，则需要生物3D打印的多组织构建。

为了满足移植需要并实现器官的生理功能，需要多细胞协同打印，且特定器官需实现特定的生理功能。现阶段生物3D打印多利用单一功能的细胞作为生物活性成分，然而器官作为多种组织结合构成的单位，包括了单种细胞无法模拟的复杂功能。有研究人员利用手术切除的部分肝脏，打印出了具备真正肝脏大部分功能的微型肝脏[35]。由此可见，要通过生物3D打印实现器官再造，需要多组织协同打印。在打印设备方面，目前通过多个打印料仓已经可以实现多材料和多细胞打印；在组织层次构建方面，也可以通过路径规划实现分区打印，但是难点在于打印后的组织培养和功能重建。以心脏为例，心肌组织的组织形态具有多层、各向异性特点，需要调控三层心肌细胞按照内纵、中环、外斜的解剖结构生长，并且心肌组织需要血管组织的滋养，以及肌肉-神经接头以响应节律性搏动。对于心房心室结构的微型心脏打印、心肌-神经接头打印、各向异性心肌组织打印，目前只有单一研究的工作，未有多组织协同打印。生物3D打印的多细胞协同打印已经引起了科研领域的重视和关注，有研究将肠道细胞、间充质干细胞、内皮细胞进行分层、分形状打印，构建了多细胞、可响应分泌的类肠道组织，在多组织构建方面获得重要突破[36]。

器官移植受者的预后与其自身的免疫状态密切相关[37]。为维持移植器官的长期存活与功能，大量的免疫抑制剂被应用于器官移植受者，以至于机体长期处于免疫抑制状态，较大程度上增加了感染与癌变的风险[38]。在通过生物3D打印制作人工器官时，使用生物相容性良好的生物材料和自体来源的细胞，将有效降低排斥反应发生的可能，但仍存在多种潜在导致排斥反应的因素。

构建生物3D打印器官的原料需多方面考虑免疫反应的可能。与同种异体器官移植不同，生物材料的多样性使其涉及的免疫反应更为复杂，但除了少数生物源性材料，一般不涉及严重的排斥反应[39]。其中，超急性排斥反应、急性排斥反应与移植器官表面抗原及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）组织配型相关，而3D打印器官所用生物材料上一般不含有上述生物标志物，材料中所包含的种子细胞一般也是自体细胞，所以较少发生这两类排斥反应。对于生物材料引起的免疫反应，以异物反应和慢性排斥反应较为常见，主要表现为急性期炎症反应：巨噬细胞和中性粒细胞迁移并黏附于移植区域，大量的组胺、趋化因子、蛋白水解酶、活性氧释放；而后进入慢性期，在干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）等促炎因子激活的M1型巨噬细胞的作用下，持续诱导肉芽组织生长和组织纤维化，导致移植器官的纤维化、瘢痕化[40]。另一方面，生物材料的降解速率和降解产物需与组织匹配。如聚乳酸材料虽然生物相容性良好，但其长达数年的缓慢降解可导致酸性pH环境诱发无菌性炎症[41]，采用降解速率与机体匹配且降解产物具有良好组织相容性的生物材料，可以有效降低材料降解后成纤维细胞瘢痕化填补引起的组织慢性纤维化及慢性排斥反应。

改善机体的创伤微环境有利于减轻人工器官引起的免疫反应。目前关于生物3D打印组织器官的植入研究，体内实验多基于损伤后即刻移植的动物模型，但病理状态和急性创伤条件下机体往往已经发生了免疫反应。根据以往报道，应对机体损伤的免疫反应策略包括：（1）以微创方式进行移植可减轻炎症和免疫反应；（2）调控巨噬细胞的M2极化状态可有效改善机体炎症微环境，对应生物材料的理化性质，以往研究显示材料表面亲水性、亚微米的粗糙表面形貌、纳米级微孔可招募更多的巨噬细胞并促进M2极化，材料硬度以及机械刺激对巨噬细胞的表型极化也有调节作用[42-43]；（3）调控免疫细胞与生物材料之间的相互作用，以实现3D打印器官的免疫耐受[44]，如信号调节蛋白α（signal regulatory protein α，SIRP α）-CD47有助于髓源性抑制细胞产生移植物的免疫耐受，避免巨噬细胞对人工器官的吞噬[45]。

目前常用于器官打印的生物材料在机体免疫应答中涉及的免疫机制各不相同，但无论是器官移植受者自身的成体干细胞作为生物墨水，还是高分子材料生物墨水，都不可避免遇到移植后炎症反应这一棘手的问题，如何妥善降低移植后炎症反应的严重程度将较大程度上决定器官移植受者预后好坏，这是未来学者们需要着重攻克的难题。

综上所述，生物3D打印技术在医学领域应用广泛，在器官再造领域具有独特的优势，被给予相当高的期望。虽然当下生物3D打印技术尚无法构建可用于器官移植的产品，存在免疫反应、血管化、多组织打印、仿生结构等诸多方面的瓶颈，但这些难题既是挑战，也是机遇。我们有理由相信在不久的将来，生物3D打印能够在人工器官制备方面取得突破，推动器官移植和个性化医疗的发展。