期刊速递 | 海藻酸钠/明胶3D生物打印支架联合神经干细胞和少突胶质细胞促进脊髓损伤后的神经再生

DOI：https://doi.org/10.1093/rb/rbac038

实验程序流程框图：（A）组分材料制备；（B）梯度支架组装；（C）材料表征；（D）体内血管生成和骨诱导性评价

干细胞与生物材料支架联合移植是治疗脊髓损伤的有效方法，3D生物打印技术可使支架与细胞更准确结合并有效提高脊髓损伤的治疗效果。本研究中设计并打印了一种载有神经干细胞和少突胶质细胞的海藻酸钠/明胶生物支架，移植到横断的大鼠脊髓损伤模型中，然后进行免疫荧光染色、苏木精-伊红染色和行为评估。结果表明，该3D生物打印支架可以促进运动功能恢复、神经生成和轴突生长，在脊髓损伤修复中表现出明显的治疗效果，表明这种新型3D生物打印支架是细胞移植的良好载体，可以同时负载多种种子细胞促进损伤后脊髓的修复。

脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）是一种严重的创伤性损伤，目前临床上缺少有效的治疗方法。利用3D生物打印技术将生物材料和细胞结合制备细胞支架可以促进SCI修复治疗方法的探索和发展。神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)具有分化为神经元的潜能，可以替代受损的脊髓组织，并/或分泌多种神经营养因子以恢复SCI，已作为种子细胞被广泛应用于SCI的研究。此外，研究表明少突胶质细胞（Oligodendrocytes，OLGs）移植后可以通过促进轴突髓鞘的再生实现受损脊髓的修复。

课题组以海藻酸钠和明胶为原料制备3D生物打印基质水凝胶， NSCs和OLGs为种子细胞，通过3D生物打印技术构建多孔细胞支架。将支架移植到横断的大鼠脊髓中，研究该支架对SCI的修复效果。

结果显示，制备的海藻酸钠/明胶水凝胶具有良好的生物相容性，细胞在支架上吸附和增殖，移植到SCI模型后可以更好地发挥作用。苏木精和伊红（H&E）染色显示移植后脊髓损伤部位未见明显空洞。免疫荧光分析显示，与单纯脊髓损伤或海藻酸盐/明胶水凝胶支架相比，载有NSCs和OLGs的海藻酸盐/明胶支架移植到SCI部位后明显改善了后肢运动功能，促进了神经再生。这些结果表明，这种新型3D生物打印支架是细胞移植的良好载体，从而促进损伤后脊髓的修复。

一、海藻酸钠/明胶水凝胶支架的表征及生物相容性

通过扫描电镜可以观察到水凝胶的多孔微观结构（图1A），流变仪和力学实验的结果显示了水凝胶具有良好的机械强度和力学性能，适合3D打印和体内移植（图1B-D）。将NSCs和OLGs与水凝胶混合，进行3D生物打印，固化后得到细胞支架(图1E)。支架具有均匀的网格结构(图1F)，有利于新生神经元定向延伸，促进轴突再生，加快损伤修复。Calcein-AM/PI染色显示NSCs和OLGs在支架中具有良好的生存能力(图1G)。3 天后细胞活率约为83%，5 天后下降至76%(图1H)。这些结果表明，3D生物打印海藻酸钠/明胶支架具有良好的生物相容性，为NSCs和OLGs的粘附和生存提供了合适的微环境。

图1 海藻酸钠/明胶水凝胶的特性及生物相容性

二、3D生物打印的细胞支架可重塑损伤脊髓组织结构并促进运动功能恢复

运动功能的恢复是脊髓损伤治疗中最重要的指标和目标。术前大鼠BBB评分均为21分，术后观察SCI大鼠的后肢运动功能恢复情况。显然，无任何治疗的SCI组的恢复速度是最慢的，术后第8周BBB评分仅为2 ~ 3分，海藻酸钠/明胶水凝胶支架组的BBB评分略有提升，约为5 - 6分，而细胞/支架组的BBB评分则达到了10-11分，明显高于SCI组和支架组（图2 A)。这些结果表明，负载NSCs和OLGs的3D生物打印细胞支架明显促进了大鼠SCI后运动功能的恢复。功能恢复与组织结构重塑和病理生理有关。H&E染色结果显示SCI组损伤脊髓组织部位结构松散、紊乱，细胞/支架组未发现明显空腔，说明了3D生物打印细胞支架在促进损伤修复方面的优势(图2B)。

图2 运动功能恢复及组织学评估

三、3D生物打印的细胞支架可改善脊髓损伤大鼠的神经再生

最近的研究表明，外源性或内源性NSCs新分化神经元在SCI后产生了一个通过病变部位的中继，将损伤的两端重新连接起来。术后8周的组织切片免疫荧光染色显示，Tuj-1在细胞/支架组中的表达明显高于支架组和SCI组 (图3A和C)。相反，支架组和SCI组损伤部位检测到更多的GFAP阳性细胞，尤其是支架组，细胞/支架组的星形胶质细胞增生明显减少(图3B和D)。

轴突再生对于神经信号在损伤脊髓节段之间的传递至关重要。髓鞘碱性蛋白标记物MBP染色和神经丝标记物NF染色检测损伤脊髓再生轴突的髓鞘化情况(图4A-D)。免疫荧光染色结果显示，术后8周，三组损伤部位均分布有NF特异性神经纤维 (图4A)。定量分析表明，与SCI组和支架组相比，细胞/支架组再生的NF阳性轴突更多 (图4B)。与SCI组相比，细胞/支架组损伤部位MBP阳性轴突数量明显增加 (图4D)。虽然细胞/支架组MBP阳性细胞数量多于支架组，但两组间差异无统计学意义。研究表明，5-HT神经纤维有助于调节脊髓网络的活动，参与脊髓损伤后脊椎动物的运动行为。5-HT免疫荧光染色显示细胞/支架组比SCI组有更多的5- HT阳性轴突 (图4 E-F)。我们的研究结果清楚地表明，新型3D生物打印海藻酸钠/明胶支架结合NSCs和OLGs有利于脊髓损伤部位神经元的再生和组织结构的改善。

图3 3D生物打印的细胞支架在体内促进神经再生，抑制星形胶质细胞形成

图4 3D生物打印的细胞支架促进髓鞘化和轴突再生

四、研究展望

本研究也有一定的局限性，在神经功能的评价方面还存在一些不足，如电生理测定。为了探索移植的NSCs的命运，我们使用CM-Dil标记的NSCs进行3D生物打印。移植的8周后，我们未能在损伤脊髓标本切片中检测到相应的荧光信号。免疫荧光染色结果显示，损伤部位的神经元和星形胶质细胞并非直接来源于移植的NSCs。因此，我们推测外源的NSCs在移植后并没有长期存活，脊髓损伤部位更多的Tuj-1阳性细胞来自宿主轴突，而不是来自移植的NSCs直接分化，可能还存在一些未知的机制。另外，移植的NSCs也可能通过分泌神经营养因子发挥作用。在探索打印支架的功能恢复机制方面，我们还有很多工作要做。