转载 EFL EngineeringForLife 2022-11-14 00:00 发表于江苏 如有侵权，请联系。
EFL推出的蛋白/药物与光固化水凝胶偶联的小工具-丙烯酰化聚乙二醇NHS酯（AC-PEG-NHS）可与系列光固化水凝胶（GelMA、HAMA、AlgMA等）通过光引发方式发生化学偶联，实现目标药物的偶联负载。那么，化学偶联是否会影响活性蛋白的生物特性？以及不同负载方式（物理混合、丙烯酰化聚乙二醇NHS酯共价固定等）下活性蛋白对细胞的生物功能有何影响呢？
本期，EFL通过问答形式以该篇应用案例解读研究者通过AC-PEG-NHS将干细胞因子（SCF）共价固定于GelMA水凝胶的设计方法，以及该方法对造血干细胞（HSC）的活力、增殖及原始表型维持的影响，供大家参考和学习。
Biomaterials：共价固定干细胞因子对造血干细胞的选择性影响；2015
10.1016/j.biomaterials.2015.07.042
干细胞因子（SCF）的固定方式：通过AC-PEG-NHS共价固定
研究方法：研究者提出四种因子作用于细胞的负载模型，并探究不同负载模型下，GelMA水凝胶3D环境中因子对造血干细胞的功能活性影响
研究结果：基于AC-PEG-NHS的共价固定方式保留了SCF的原始生物活性，可稳定与GelMA水凝胶结合并保留7天以上。在含有共价固定化SCF的GelMA水凝胶中培养的小鼠造血干细胞提高了原始造血干细胞的选择性。
图1 负载SGF因子的GelMA凝胶网络模型图（注：No SCF: 无因子负载的GelMA水凝胶；Transient SCF：因子物理混合于GelMA水凝胶中；Continuous SCF：因子物理混合于GelMA水凝胶，并培养在含有SCF的培养基中；Covalent SCF：SCF共价固定于GelMA水凝胶中）
1. AC-PEG-NHS如何与小鼠重组干细胞因子（SCF）结合，实现双键化修饰？具体的试验条件是什么？
AC-PEG-NHS与小鼠重组干细胞因子（SCF）在pH 8.0的PBS中以摩尔比24:1 (AC-PEG-NHS: SCF)在室温下反应即可得到。
未反应的AC-EG-NHS可使用10K MW蛋白质浓缩管（Pierce™ 蛋白浓缩管 PES）去除。
采用酶联免疫吸附（ELISA）测定PEG-SCF的浓度。
使用15%预制聚丙烯酰胺凝胶（Tris-HCl 预制胶）电泳确定蛋白质成功接枝双键。Western Blot分析显示，未修饰的SCF在18.3 kDa处有一个离散带，PEG修饰的SCF (PEG-SCF)在在 40-60 kDa 处显示出宽条带。表明每个SCF分子修饰有丙烯酸化PEG链段。
试验表明，在缺乏SCF的培养基中，造血干细胞的细胞数量显著减少。在含有可溶性SCF和PEG-SCF培养基中，造血干细胞的增殖率明显增加，证实双键化修饰的SCF仍然具有生物活性。
6. 双键化修饰的SCF（PEG-SCF）如何保存？
PEG-SCF可溶解于0.1%BSA的PBS(pH=7.4)中，-80℃保存。
将PEG-SCF以100或400 ng/mL添加到GelMA5% (w/v)的凝胶前驱体溶液（含0.1%LAP）中，光固化交联形成锚定SCF的水凝胶网络。
8. 如何观察PEG-SCF在水凝胶内滞留的荧光成像？
通过荧光分析确定GelMA水凝胶中SCF的保留率。将凝胶置于PBS中，放在培养箱(37℃，5%CO2)中培养7天。第2、4和7天，将样品经冷冻切片、荧光染色，进而对凝胶网络中的SCF进行监测。
在PBS（37℃，5% CO2培养箱）中测试SCF的释放。0.5、2、4和7天后提取PBS，冷冻干燥至分析体积（frozen at -80 ℃ until analysis），用酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒定量。瞬态包封的SCF快速（<12小时）释放到培养基中（约60%的初始掺入量），相比之下，基质中共价掺入的PEG-SCF的80%以上在培养物中保留7天。
10. 如何设置对照组，探究SCF的固定与否对细胞的影响？
将LSK细胞以5×105 个/mL混在预聚物溶液，光交联后共培养。空白组：GelMA水凝胶在无SCF培养基中培养；瞬态SCF：含有100 ng /mL SCF的GelMA水凝胶在无SCF培养基中培养；连续SCF：含有100 ng /mL SCF的GelMA水凝胶在含有100 ng /mL SCF的培养基中培养；共价SCF：SCF共价修饰的GelMA水凝胶（共价Lo: 100 ng/mL;共价Hi: 400ng / mL）在无SCF培养基中培养。
11. 利用AC-PEG-NHS实现的试验结果是怎样的？
AC-PEG-NHS功能化的SCF保留了SCF的原生生物活性，可以稳定地与GelMA水凝胶结合并保留7天以上。在含有共价固定化SCF的GelMA水凝胶中培养的小鼠造血干细胞增殖减少，并提高了维持原始造血干细胞的选择性。
