《AFM》 3D打印具有可调弹性的工程三维水凝胶组织和器官模体

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三维组织器官体模与活体器官、动物模型、人体临床试验以及先进的虚拟现实等医疗辅助方案相比，不仅真实地反映了生物体的生物结构、形态和生理微环境，而且具有成本低、符合伦理道德、易于操作等优点，在手术训练和生物医学设备测试中尤为重要。目前体外器官体模的制作和应用仍受到两大问题的制约。一方面，模塑器官体模缺乏精准仿制生物器官复杂结构特性的能力。另一方面，目前的器官体模无法精确模拟生物体的理化特性，如柔韧性、粘弹性等。

 

2023年1月14日，来自中科院兰州化物所刘维民院士/王晓龙研究员及其团队在AFM杂志发表题为“Engineering Tridimensional Hydrogel Tissue and Organ Phantoms with Tunable Springiness”的研究论文，提出了一种基于共价交联网络和金属配位网络的双交联网络策略来制备刚度可调的弹性水凝胶，其弹性模量（软硬度）可以通过调节水凝胶组分和金属配位键的密度，使其灵活调控从几千帕到几百千帕之间来匹配不同的生物软组织，同时借助数字光处理3D打印技术实现结构复杂、保真度高、机械可调的湿滑水凝胶软组织器官，这些水凝胶软组织器官模型还具有复杂的内部通道和腔体结构、血管化组织结构、解剖结构等。该仿生水凝胶软组织器官模型在外科手术训练、医疗设备测试和器官芯片等领域具有较大的潜在应用前景。

 

1.   具有组织样柔软性的弹性水凝胶的制备

 

对于生物组织，包括软组织(脑、肺、肝、心、肾、肠、胃等。)和硬组织(骨骼)，杨氏模量从几个Pascal到几百个兆帕不等。因此，具有可调节刚度和类组织柔软性的弹性水凝胶有可能弥补两者之间显著的力学差异。在此，研究者提出了一种具有类组织柔软性的双网络(Double network, DN )弹性水凝胶，以实现目标组织匹配的机械性能，可通过调节水凝胶墨水成分和金属配位键的密度来控制。其中，光固化水凝胶油墨成分由单体丙烯酰胺(Monomers acrylamide, AAm )和2 -丙烯酰胺基- 2-甲基丙烷磺酸(
2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, AMPS )、化学交联N, N ' -亚甲基双丙烯酰胺( N, N'-methylenebis-(acrylamide), MBAA )、水溶性光引发剂苯基-2,4,6 -三甲基苯甲酰次膦酸锂(lithium phenyl-2,4,6trimethylbenzoylphosphinate, LAP )和水溶性光吸收剂柠檬黄。将这些成分溶解在去离子水中形成均匀的水凝胶光敏油墨，然后暴露在紫外光源( 405 nm )下，通过AMPS和AAm链之间的自由基共聚形成共价交联的水凝胶(编码为已制备的水凝胶)。将制备的水凝胶依次浸泡在ZrOCl2溶液中，通过AMPS链上的磺酸基团与Zr4+之间形成的金属配位键制备Zr4+配位水凝胶。将Zr4+配位的水凝胶在去离子水中进一步平衡，透析掉多余的离子以达到稳定的配位，即为平衡水凝胶。（图1）

 

图1 DLP 3D打印具有类组织柔软性的弹性水凝胶制备组织和器官仿体的示意图

 

 

2.  类组织柔软性水凝胶的力学和结构表征

 

力学表征探究了所制备的水凝胶、Zr4+配位水凝胶和平衡水凝胶的机械性能的差异。由于只有共价交联网络的存在，所制备的水凝胶非常脆弱，导致水凝胶网络中缺乏有效的能量耗散。SEM图像也证实了所制备的水凝胶具有相互连通且疏松多孔的微观结构。相反，由于非平衡离子配位，Zr4+配位的水凝胶在锆溶液中浸泡后具有相对较高的机械性能。同时，Zr4+配位水凝胶和平衡水凝胶的SEM照片显示出更小的孔径和更致密的微观结构，这与所制备的水凝胶明显不同。这归因于Zr离子与AMPS链的磺酸基团之间形成了牢固的金属配位键，可以通过DN策略提高聚合物网络的交联密度和重构。此外，随着水平衡时间的延长，水凝胶的微观结构和孔径会变得越来越致密。同时，这种致密的网络结构有利于提高弹性水凝胶的力学性能。综上所述，DN策略使弹性水凝胶的机械性能可以在大范围内进行机械可调，这对于将天然组织和器官与单一水凝胶体系相匹配具有重要意义。随后进一步对这些水凝胶的结构进行了表征。（图2）

 

图2 水凝胶的力学和结构表征

 

 

为了证明DN策略可以简单而精确地调节弹性水凝胶的机械性能以匹配天然软组织和器官的柔软性，探索了水凝胶基质的组成和金属配位键的密度对弹性水凝胶机械性能的影响。回弹性水凝胶的机械性能可以通过改变来调节化学交联的密度，即MBAA的用量。当水凝胶网络中MBAA含量在0.05 ~ 0.25 mol . % (相对于单体)范围内变化时，水凝胶的σb和 Γ先增大后减小。此外，回弹性水凝胶具有适中的含水量( 61-64 % )，尺寸收缩也具有相似的趋势。随着AMPS摩尔分数从5 %增加到25 %，回弹性水凝胶的机械性能(σb, εb, E, 和Γ)逐渐增加。说明水凝胶体系中磺酸基团的增加有利于通过共价网络和配位网络协同增强其力学性能。说明水凝胶体系中磺酸基团的增加有利于通过共价网络和配位网络协同增强其力学性能。此外，随着AMPS摩尔分数的增加，水凝胶的含水量和尺寸变化均减小，进一步验证了AMPS摩尔分数的增加可以使网络结构更加致密。总之，通过调节水凝胶油墨(总单体浓度、MBAA含量和AMPS摩尔分数)的配方和金属配位键( AMPS摩尔分数和金属离子浓度)的密度，可以在很大范围内调节弹性水凝胶的力学行为。图3j总结了各种DLP 3D打印水凝胶的断裂强度和杨氏模量，以便与具有组织柔软性的回弹性水凝胶进行比较。可以看出，回弹性水凝胶的刚度在从几千帕到几百千帕的大范围内是机械可调的，从而为制造结构复杂的多种软组织模拟物提供了有前途的候选者。回弹性水凝胶的滞后环面积(耗散能)随着应变的增加急剧增加，因此，能量耗散表现出高度的应变依赖性。在连续的上百次加载-卸载循环中，恢复性水凝胶表现出相似的力学迟滞性，表明稳健的水凝胶网络结构对连续的循环变形表现出明显的软行为。这些结果表明，在回弹性水凝胶中引入共价交联网络和可逆金属配位网络可以显著改善其能量耗散和抗疲劳性能。这种水凝胶优异的弹性有利于提供更接近自然软组织和器官的触觉。简而言之，这种机械可调的设计策略提供了一种在大范围内设计具有组织匹配刚度的多个软组织和器官体模的方法。（图3） 

 

图3 类组织柔软性水凝胶在广泛范围内可调谐力学行为

 

 

3.  工程化仿生体积型水凝胶组织器官模型

 

众所周知，生物软组织具有较高的柔韧性和柔软的力学性能，且不同部位的刚度差异较大。然而，水凝胶刚度可控性差是真实构建基于水凝胶的软组织和器官体模所面临的最大挑战之一，这需要水凝胶具有广泛可调的机械性能适应性。为了满足这些要求，一系列具有可调节刚度和柔软性的弹性体水凝胶被用来模拟天然的软组织，如脑、肾、肺、气管、心、肝、胃和肠模拟的弹性水凝胶。此外，该研究还提供了3种水凝胶的最低弹性模量以覆盖人体多器官硬度范围。这些低刚度的弹性体水凝胶有利于构建相对柔软的器官模拟物，如大脑、肾脏和肺。利用DLP 3D打印的高保真度和体积复杂性，构建了几种具有代表性的仿组织结构和力学性能的水凝胶器官体模。模拟的水凝胶脑组织显示出清晰可视的脑沟。几种打印的水凝胶体积组织和器官模拟物具有结构上复杂的空腔和可灌注的微通道，如气管、心脏、胃和肠道软组织模拟物。上述都是基于挤出打印技术难以实现的性能。因此，由DN策略产生的具有机械可调刚度的弹性水凝胶，能够很容易地由DLP 3D打印结构复杂的组织和器官复制品，同时允许与生物软组织和器官的机械性能相匹配。（图4）

 

图4 具有匹配刚度和仿生结构的3D打印水凝胶体积型组织和器官体模

 

 

具有复杂解剖结构的3D打印水凝胶体积组织和器官体模对于获取临床知识和技能培训至关重要，尤其是在术前规划和医学教学中。作为概念的证明，3D打印的水凝胶体积心脏和肝脏模拟物可以提供良好的解剖细节。人体心脏解剖显示，心脏有许多复杂的腔室和壁结构。使用3D打印的全尺寸水凝胶心脏模型来可视化复杂的内部解剖结构，如肺静脉、肺动脉等。（图5）

 

图5 3D打印结构精密水凝胶心脏器官体模的解剖图

 

 

为了证明组织弹性水凝胶的粘弹性，研究还进行了流变学测量。仿心脏水凝胶的流变学频率扫描证实其表现出动态粘弹性行为。并且在整个频率范围内，储能模量始终高于损耗模量，有力地验证了水凝胶的类固体弹性特征。仿组织水凝胶的粘弹性计算为tanδ，发现该弹性水凝胶具有接近活体心脏组织的流动性能。还研究了仿心脏水凝胶的回弹性恢复行为，证实其具有动态粘弹性和触变性恢复性能。这些结果证实了弹性水凝胶的柔软性可以被精确地调节以匹配具有类似生物软组织粘弹性的各种组织和器官体模。此外，人体肝脏解剖发现内部存在大量错综复杂的血管脉络。为此，也打印了具有复杂仿生物血管网络和可灌注性能的水凝胶体积型肝脏体模。发现水凝胶肝脏解剖体模在形态外观、精致血管网络和内部结构方面具有高质量的保真度。水凝胶肝脏体模(肝左、右叶)的解剖细节清晰地显示了一些内部结构特征，包括肝门静脉、肝中静脉、肝左静脉和微小血管网络结构。总的来说，3D打印的水凝胶体积器官体模具有一定的柔韧性和弹性，这些水凝胶体积器官体模还有利于更好地理解和可视化生物组织和器官的内部解剖结构，积累临床经验，获得真实感的操作体验，在术前规划和医学教学/培训中发挥重要作用。（图5）

 

4. 仿生灌注多通道结构和多血管网络

 

众所周知，人体实体器官包含不同的灌注网络和复杂的血管拓扑结构。利用现有技术在软材料中创建结构复杂的血管网络是有限的，并且缺乏可调性和可扩展性。为了展示在所有三个维度，设计了许多可灌注的多通道和多血管网络，这些网络具有可调节的管状拓扑结构和在组织状柔软水凝胶基质中的复杂结构。各种可灌注的多通道网络，包括具有两个明显独立分叉的1D平行通道，顶部和底部交替缠绕构型的2D相互交织通道，以及具有轴向和螺旋结构的3D缠绕无支撑悬垂通道，在组织状柔软水凝胶基质中精确地图案化。有色染料灌注验证了两个独立通道之间的结构保真度、通道通畅性和连通性以及流体的独立性。分等级的分支和互穿的多血管网络拓扑结构是天然血管系统的标志，在许多生物组织中普遍存在。为了实现这一点，通过DLP 3D打印在整体组织样柔软水凝胶中设计并制备了仿生分支和迂回的多血管网络。发现高度曲折的分叉血管网络包括可灌注通道和丰富的连接分支的3D网络。染色灌注进一步证实，整体式水凝胶中的血管网络完整且连续，这是挤出打印难以实现的。

 

此外，原生血管的尺寸从毛细血管到大动脉和静脉跨越几个数量级。然而，在水凝胶基质中构建多级分支动脉树在该领域尚未出现。为了展示在体内制造渗透血管网络的仿生多尺度人工血管的能力，我们设计了一种在整体组织样柔软水凝胶内具有不规则分叉和通道尺寸的仿生树枝状血管网络。相应的仿生树突状血管结构可以用Rh B溶液连续灌注到所有分叉中，表明树突状水凝胶血管网是不分裂的、连续的。仿生树突血管的荧光照片进一步证明了不同内部血管拓扑结构的相关结构特征。在这种体积可视化中，我们展示了在具有水环境的整体水凝胶中设计复杂的多血管网络的能力，这有望增加它们在体外组织工程中的应用，如芯片实验室和微流体装置。总之，DLP 3D打印结合弹性水凝胶为血管化工程组织和灌注结构的设计和制造提供了合适的蓝图。（图6）

 

图6 在类组织柔软性水凝胶基质中构建仿生灌注多通道网络和复杂的多血管网络

 

 

5. 用于体外模拟过程的Slippery Hydrogel体积器官模型

 

缺血性脑卒中( cerebral ischemic stroke，CIS )通常是脑血管缺血的急性期，脑动脉闭塞常导致脑梗死或损害。因此，早期血管内介入治疗是治疗血管内病变最有效的方法。为了提高临床治疗的准确性，出于伦理成本的考虑，3D血管复制品代替人的尸体和活体动物成为血管内介入治疗真实感模拟必不可少的训练平台。为了实现这一点，研究设计了一个具有复杂曲折脑动脉的人脑体模，作为血管内介入真实感模拟的有效训练平台。为了在更真实的环境中进行模拟测试，对水凝胶人脑体模中的脑动脉进行染色，以提供清晰的血管网络视图。研究发现，弹性水凝胶内部扭曲的脑动脉清晰可见，具有复杂的环形节状通道结构。如图7g所示，血管内介入手术在水凝胶脑血管网络内使用医用导丝进行模拟训练。在这种情况下，水凝胶体模内表面的摩擦性能对导丝导航仿真起着至关重要的作用。研究发现，与传统的用于制作器官体模的软材料(如PDMS和PU基质)相比，水凝胶的类组织柔软性由于其高含水量和润湿性而大大降低了摩擦。此外，这些弹性体水凝胶的润滑性能的提高是由于水在载荷作用下被挤出，这表明它们比传统的软组织模拟材料( PDMS和PU)最大的好处是优异的滑爽性能。因此，基于滑水凝胶的器官仿体可以重建与天然血管相似的环境。简而言之，模拟结果表明具有复杂血管复制品的3D打印水凝胶人脑体模可以作为体外模拟血管内介入的真实感平台，从而有潜力为解决血管内介入领域的一些临床和技术挑战开辟道路。（图7）

 

图7 在具有复杂脑动脉和滑行特性的3D打印水凝胶人脑体模内进行导丝导航的体外演示图

 

 

总之，本研究提出了具有类组织柔软性的新型3D可打印弹性水凝胶，适用于模拟具有接近天然软组织的生物结构和机械性能的组织和器官仿体。通过控制单体组成和金属配位的密度，基于DN策略的弹性水凝胶的机械性能是广泛可调和精确可控的。结合具有可调节刚度的弹性水凝胶和DLP 3D打印，精细制备了各种结构和机械性能与天然软组织相匹配的复杂体积水凝胶器官体模。3D打印的机械坚固的水凝胶心脏和肝脏模拟物具有良好的结构保真度、相互连通的空腔和灌注的血管样通道，甚至真实的解剖外观。此外，一些具有复杂几何结构和内部相互连通的空腔结构的仿生结构，如复杂的流体通道、高度分支的树枝状血管，甚至仿生的多级血管网络，也可以巧妙地在整体组织样柔软水凝胶中实现。而具有迂曲脑动脉和湿润润滑特性的3D打印水凝胶人脑体模可作为体外逼真模拟血管内介入治疗的有效临床手术训练平台。综上所述，基于3D打印水凝胶的柔软度可机械调节的体积型组织模拟物被认为具有广泛的应用前景，可作为新型医疗器械体外需求测试、术前排练和医疗培训的可展开平台。