人造肉的细胞培养生产工艺研究

人造肉生产的第一步是产生足够储备的起始细胞。英国伯明翰阿斯顿大学最近发表在BB期刊的文章，在旋转烧瓶上采用微载体培养技术扩增细胞，在这项研究中，采用具有向脂肪和肌肉分化的能力牛脂肪源性干细胞（bASCs）作为起始细胞，并优化培养工艺，如细胞接种密度（1500、3000和6000个cells/cm²）和补给策略（80%、65%、50%和80/50%混合培养基交换）。结果显示采用1500个细胞/cm²的接种密度和80%的培养基交换可获得28倍的扩大率，大规模培养处理后，bASCs向成脂肪、成骨和软骨细胞分化的能力保持不变，且其克隆性没有任何改变。

随着人口的增长，对可持续、蛋白质丰富的食物来源需求也随之增加。联合国粮食及农业组织（FAO）2016年的报告预测，到2025年，肉类需求将增加48兆吨。当前动物农业占据了70%的可耕土地，产生14.5%的人为温室气体排放，并且消耗27%的淡水资源用来牲畜饲料生产，因此传统的畜牧业和产肉方式无法支持肉需求，从而产生人造肉的需求。替代的人造肉技术的真正工业化生产则需要生物反应器的使用来保证必需的规模。人造肉可以为消费者提供一个潜在的更健康和更安全的选择，因为生产过程可以被严格调整和控制，以生产出不含抗生素、不含人畜共患病细菌和病毒的肉类，并具有自定义的理想营养水平。

目前，要想实现将商业的人造肉推向市场，需要提升人造肉产量，降低生产成本。肉是由几种不同类型的细胞（脂肪、肌肉和结缔组织细胞）组成的。在选用细胞上，间充质干细胞具有向脂肪细胞和肌细胞分化的能力并且容易从不同组织中分离出来，牛脂肪源性干细胞（bASCs）具有向脂肪细胞和肌源性细胞分化的能力，是一种适合于生产养殖肉制品的细胞来源。因此本文采用牛脂肪干细胞（bASCs）作为目标细胞。

人造肉生产的第一步是扩大阶段，即生产优质的起始细胞。据估计，从肌肉细胞生产1kg蛋白质所需的细胞数量约为2.9E11个细胞到8E12个细胞。从任何现实意义上讲，单层培养无法获得这样的细胞数量，但与搅拌生物反应器结合使用的微载体是一个更可行的选择。例如，一个5L搅拌生物反应器，每升微载体提供5000cm²的表面积。

本文工艺开发初始选择在旋转烧瓶中进行，培养规模为100至250mL。通过工艺开发，建立检测生长和细胞产品质量属性的bASCs培养基，在旋转烧瓶中开发可扩大（scale up）的生物过程，用于bASCs扩增并研究培养处理后细胞分化能力是否保持不变。

旋转烧瓶内部配备有带叶轮的磁力搅拌桨，表面涂有硅烷化以防止细胞贴附。微载体的表面积控制在5cm²/mL的。第2代和第5代间的脂肪干细胞分别以1500、3000和6000个细胞/cm²的在微载体表面接种。首次不同培养基交换率在第三天进行，接下来每个一天进行一次。日常取样技术，成像以及代谢分析（葡萄糖和乳酸）。前三天搅拌转速30rpm,接下来每两天增加10rpm来保证悬浮培养和控制微载体聚集。到培养终期，在胰蛋白酶下搅拌速加到250rpm以增强细胞从微载体脱离并且降低酶对细胞带来的潜在损伤和流体动力的压力。细胞与微载体分离后过滤，离心。

检测细胞的分化潜能：成骨分化、脂肪分化和软骨分化。将300个细胞接种在T-25瓶中，置于37℃和5%CO₂的培养箱中。培养基每3-4天更换一次，培养14天。然后移除培养基，固定染色计数。采用免疫荧光染色检测三种细胞表面标记物的表达，分别为CD73、CD90和CD105。

将细胞连续培养10代。在整个持续培养期间，对基底细胞的形态进行了监测，细胞形态成纤维状（Figure 1A）。与人骨髓间充质干细胞（hMSCs）相比，牛脂肪干细胞更小，其大小在早期传代的13μm到后期的16μm之间（Figure 1C），间充质干细胞的细胞大小增加通常与衰老和生长减慢有关；第2代细胞倍增时间为42.32±0.83h，群体倍增率为5.99±0.06。第8代细胞倍增时间为199.55±30.16h，群体倍增率为20.67±0.09，在第8代之后（大约20倍增加），细胞生长减慢（Figure 1B）。这一特征可以显示了什么范围的细胞传代可以用于生物反应器接种，以避免达到衰老。通过向成脂、成骨、成软骨三个谱系的分化、细胞表面标志物（CD90、CD73和CD105）的表达以及克隆形成潜能来评估bASCs的质量基线。人骨髓间充质干细胞表达CD73、CD90、CD105等标志物，缺乏CD34、CD45、HLA-DR、CD14、CD11b、CD19等标志物。先前的研究表明，牛间充质干细胞具有与其人类类似物相同的一些标记物（例如CD73、CD90和CD105）的阳性表达，但它们也表达其他标记物，如CD29、CD166、CD44，而不表达CD45或CD34。这里，评估CD73、CD90和CD105（Figure 1D、1E和1F）的表达，结果为阳性。

Figure 1

结果显示：① 可以实现向成骨谱系的分化，因为骨矿化被明显地染色为黑色，而碱性磷酸酶的表达明显可见红色染色（Figure 2B）。②可以实现软骨分化，因为形成了大团块并被染色成蓝色（Figure 2C），这表明软骨具有代表性的GAG（氨基葡聚糖）的强烈形成。③脂肪分化受到限制，如Figure 2A所示的有限绿色荧光所示，这表明脂肪细胞中通常存在脂质小泡。脂肪分化效率（以总细胞数中出现脂滴的细胞百分比计算）为12.1%±2.8（n=1982个细胞分析）。低脂肪分化效率可能是所使用的分化培养基配方导致。大多成脂分化培养基是专门用于人类细胞，没有考虑牛细胞和人类细胞代谢的差异，因此解释了基底细胞向脂肪细胞系分化的潜力有限。并且发现在后期传代（第7代）时克隆形成潜能显著降低（Figure 2D）。

Figure 2

Figure 3

在旋转烧瓶中进行微载体培养。细胞可以成功附着在微载体上，到第5天，观察到细胞微载体桥，如Figure 3中的白色箭头所示，这是细胞增殖的标志，并且第5天微载体上的细胞活力增加（活细胞染色为绿色，死细胞为红色）。

Figure 4

初始微载体培养是采用5000个细胞/cm²细胞接种密度，培养5天。与相同接种密度的单层培养相比，体积倍数增加、比生长率和细胞倍增时间没有显著差异。采用微载体培养，可以具有高表面积体积比。生物工艺的可扩性强，并且可以控制一个高度均匀的环境，控制pH、温度和浓度，同时增强氧传递，可以减少细胞质量的变化，并通过优化补料策略，最大限度地提高细胞生长，降低生产成本。

Figure 5

首先优化初始细胞接种密度，初始范围设定在1500~6000个细胞/cm²。微载体培养持续9天。在6000个细胞/cm²下，细胞数量在第5天呈指数增长，随后快速死亡，此时也开始观察到细胞聚集（Figure 5B）。在3000个细胞/cm²下，存在一个轻微的滞后期，直到72小时后，细胞数量不断增加。在1500个细胞/cm²下，没有观察到滞后期（Figure 5A）。

Figure 6

在培养结束时，细胞生长方面展现一致的趋势，即最低的细胞接种密度为1500个细胞/cm²，其体积倍数显著提高至28.8±2.29倍（Figure 6A），同时展现更高的比生长率（Figure 6B）和更低的倍增时间（Figure 6C）。在相同的生物反应器尺寸下可以实现更多的加倍，因此选择1500个细胞/cm²的细胞接种密度作为下一组实验，研究补给策略的影响。

在旋转烧瓶培养中，为避免微载体的吸入导致细胞损失，不能进行100%的培养基交换。因此研究了4种不同的培养基交换方案：50%，65%，80%培养体积的交换，以及在第3天进行80%的交换，其余进行50%的交换。对于所有研究的补给策略，在第3天和之后每隔一天进行一次培养基交换。在整个培养过程中，80%的培养基交换产生了最高的细胞数（Figure 7A），体积倍增达到28.01±2.59（Table 1），倍增时间为45±1.28 h（Table 1）。

Table 1

Figure 7

由于扩大生物工艺所需的大量培养基，因此培养基在生产成本中占很大比例。可以通过优化培养基成分、回收培养基及其部分成分或设计补给策略，以尽量减少培养基消耗并最大限度地提高细胞产量等策略降低成本。对在旋转瓶中以100ml的工作体积进行9天的微载体培养所需的耗材和试剂进行了成本分析。成本分析中的主要变量是由于不同的交换策略而使用的培养基量。考虑生产获得的细胞，采用80%的培养基交换可以获得最低的生产成本。说明在培养的早期阶段，营养物质的有效性和代谢产物的缺乏对细胞的生长非常重要。牛脂肪干细胞在旋转烧瓶中进行微载体大规模培养后，仍可以保留自身向脂肪，成骨，成软骨的分化能力，并且在克隆上任何培养基交换策上，都未受到显著影响（Figure 9）。

Figure 8

Figure 9