细胞治疗：人工改造细菌用于治疗癌症

  转载原创 细胞与基因线路设计 2022-12-07 17:15 发表于广东 如有侵权，请联系。

细菌在19世纪首次被确定为潜在的癌症治疗方法，在注射了化脓性链球菌和粘质沙雷氏菌的患者中观察到了肿瘤消退的迹象，这是因为细菌是免疫刺激的，可以将免疫反应靶向肿瘤，也可以优先在低氧和免疫抑制的肿瘤微环境（TME）中生长。沙门氏菌属、大肠埃希菌属、梭状芽孢杆菌属、双歧杆菌属、变形杆菌属和乳杆菌属等几个属已经表现出这些特性，表明它们作为肿瘤靶向载体是有用的。

虽然细菌种类繁多，可用性强，但是其自带的生物性能的不可控性以及安全问题限制了它们作为药物来治疗肿瘤。然而，有越来越多的证据表明微生物能在肿瘤中定植，并且随着合成生物学的发展，合成生物学能够精确调整细菌与其它细胞以及不同技术的互动，合成生物学工具正被用来改造细菌作为肿瘤特异性递送系统。这些工程化系统可以利用其固有的免疫原性和局部有效载荷的组合来调节TME。

哥伦比亚大学的Tal Danino教授等人于2022年11月24日在《Science》专刊“Cell Engineering”上发表了综述“Engineering bacteria as interactive cancer therapies”，该文章总结了通过合成生物学方法构建的工程菌在癌症治疗中的应用，介绍了能够加强治疗细菌空间和时间控制的基因线路，从而提高治疗的安全性和有效性。另外，文章重点介绍了在工程鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌模型系统方面的进展，并探索了合成基因线路如何使细菌能够更有效地与其他生命和非生命形式互动。 

肿瘤具有和低免疫监视等特征，因此注射细菌在肿瘤中的积累可以比其它组织强约10,000倍。然而，一些菌株也可以在健康的器官中生存或生长，这促使需要通过基因减毒来降低固有的毒力和内毒素。

一个值得注意的例子是减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009菌株，它包括染色体上purI和msbB的缺失，这种purI缺失的细菌菌株对腺嘌呤具有营养缺陷，msbB缺失则通过修饰的脂多糖降低了肿瘤坏死因子-α（TNFα）介导的毒性，使细菌的免疫原性降低。总之，根据TNF-α的测量，这些减毒药减少了小鼠的全身炎症。在转移性黑色素瘤患者的临床评估中，静脉注射VNP20009通常耐受性良好，但不能有效地定植肿瘤，也没有提供治疗益处，这显示出了细菌治疗肿瘤存在安全性和治疗效果的挑战。

提高细菌肿瘤特异性的策略包括突变和定向进化，这两种策略分别选择在肿瘤内增加相对生长的营养缺陷型细菌或与癌细胞粘附性增加的菌株变种。或者，细菌可以被改造成在其膜上表现肿瘤靶向部分，如粘附肽和肿瘤相关抗原。

另一种改善肿瘤靶向性的方法是利用基因线路，将细菌生长与肿瘤特征相耦合，如高浓度乳酸、低氧和低pH。在这些传感线路中，细菌生长的必需基因的转录由细菌启动子控制，这些启动子响应于这些环境信号，从而细菌限制了肿瘤的生长。由于其它组织可能包含这些信号之一，因此通过“AND”逻辑门组合传感线路可以进一步提高肿瘤的特异性，减少了细菌突变逃逸的情况，从而实现更长期的生物遏制。

一旦进入肿瘤内部，细菌可以将它们的有效荷载定位在肿瘤细胞内（图1A-1D）或细胞外（图1E-1F），通过分泌、扩散或裂解的机制释放。

图1 细菌定植于肿瘤细胞并释放有效载荷

细菌具有先天的免疫原性，可以通过与TLR-4和TLR-5的结合来重塑TME，其中TLR-4和TLR-5分别由细菌内毒素（LPS）和鞭毛蛋白刺激。它们的存在还可以招募中性粒细胞、自然杀伤细胞和单核细胞等先天免疫细胞涌入肿瘤，并改变常驻巨噬细胞的表型，从而重塑TME（图2-1）。

随着免疫细胞渗透到肿瘤中时，细菌被吞噬，从而提供了在细胞内递送免疫细胞特异性荷载的机会。例如，有大肠杆菌已被改造为将STING激动剂递送至肿瘤内APCs，从而诱导IFN-I应答（图2-2A）。有鼠伤寒沙门氏菌被编码为在其外膜上表达新抗原，一旦进入肿瘤内部，它们就可以被周围的树突状细胞裂解、吸收和呈递（图2-2B）。总之，当细菌裂解产物在坏死的肿瘤核心内释放，或细胞和体液免疫成分杀死和吞噬细菌时，细菌的免疫刺激增加。

除了固有的免疫刺激功能，还可以利用合成生物学技术改造细菌，潜在地与细菌引起的固有免疫激活协同作用，以增强多种肿瘤类型的细菌癌症治疗的总体疗效。这些细菌能够通过产生细胞因子和趋化因子等免疫调节剂来激活适应性免疫系统，将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）招募至肿瘤（图2-3A）。除了直接产生免疫调节物质外，它们还可以被设计成将肿瘤代谢产物转化为L-精氨酸等代谢产物，这与TIL的频率增加有关，从而重塑TME（图2-3B）。

总而言之，多项研究表明可能可以利用免疫反应的固有时间结构来调整细菌与免疫细胞的相互作用。在反应的每个阶段，细菌可以产生有效载荷与特定的免疫细胞通信，从而重新编程更有效的抗肿瘤反应。

图2 利用合成生物学方法改造细菌

细菌除了与TME内的肿瘤和免疫细胞相互作用外，还可以与其它技术和材料互动联用（图3），以改善诊断和治疗。

PET和MRI等成像技术可以与天然细菌或工程菌联用，以增强肿瘤和细菌原位定位的可视化。聚焦超声（FUS）成像技术能够以高空间分辨率深入组织，使工程菌能够在精确的位置被可视化和远程操纵，当细菌编码有声报告基因或热开关时，FUS可用于激活治疗释放。此外，FUS与细菌联用可以作为一种机械疗法，其中细菌编码微米级的空化气泡，释放强大的局部机械效应，破坏和杀死组织和细胞，进一步裂解细菌并释放治疗性负荷。

载药纳米颗粒可以在物理上与细菌结合，帮助它们输送到肿瘤深处。通过促进细菌-免疫细胞相互作用，辐射等外部治疗方式也可以与细菌和纳米颗粒疗法相结合。涂有带正电荷的聚酰胺胺树枝状聚合物纳米颗粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌（VNP20009）可以通过静电相互作用来结合带负电荷的抗原。当免疫抑制肿瘤受到照射时，肿瘤抗原被释放，然后工程细菌可以将抗原运输到肿瘤周围的功能性树突状细胞，引发针对肿瘤的强烈全身免疫反应。

除了以上非生物技术和材料联用，工程菌还有可能被设计为与其它活细胞形式之间相互作用。在一般情况下，细菌可以重塑TME，使其更有利于其它微生物和细胞疗法，例如细菌与溶瘤病毒的结合使用，细菌可以耗尽TME中的抗病毒细胞因子，增强溶瘤病毒的复制，从而更有利于溶瘤病毒的治疗。合成的细菌联合体还可以与肿瘤内微生物协同作用，以促进可预测的免疫反应或限制促癌细菌的数量。

细菌可以与CAR-T细胞疗法相结合，CAR-T细胞可以被细菌佐剂激活，并被编程为对细菌释放的合成抗原作出反应。此外，有研究报道了一种减毒的羊布鲁氏菌菌株，能促进肿瘤巨噬细胞的促炎性M1极化，并增加肿瘤内CD8+T细胞的频率，当将其与CAR-T细胞一起用于治疗结肠癌的小鼠模型时，小鼠的肿瘤负荷较低，存活率显著提高。

这些技术结合在一起，创造了生命和非生命形式的系统，其中每一种单一疗法都可以补充另一种疗法的局限性，从而产生总体改善的结果。

图3 工程菌与其它技术和材料的互动联用

细菌是一种多功能的平台，可以作为单一试剂或与其它方式结合来改进肿瘤诊断和治疗。细菌本身具有免疫刺激性，能够将免疫反应靶向肿瘤。它们可以进一步进行工程改造，以产生细胞外和细胞内的各种有效载荷。由于肿瘤核心内有利于细菌聚集，药物的空间和时间释放不同于传统的全身治疗，从而减轻脱靶毒性，并获得其它方式难以达到的治疗靶点。

尽管在细菌癌症治疗的进展方面取得了实质性进展，但在临床转化过程中需要评估生物抑制和安全性问题。卡介苗（BCG）是一种临床上用于膀胱癌治疗的减毒牛分枝杆菌菌株，这为FDA批准细菌用于癌症治疗提供了基准。