《Biomaterials》：一种具有肌肉收缩监测功能的3D肌管培养芯片

转载 原创 EFL EngineeringForLife 2022-12-26 00:00 发表于江苏 如有侵权，请联系。

为了医疗保健和研究，医生和研究人员需要评估肌肉病变患者的肌肉功能。骨骼肌功能收缩的量化对于评估神经肌肉疾病治疗程序的结果至关重要。肌肉三维“器官芯片”模型通常需要大量的生物材料，而这很少能从患者的活检中获得。巴黎大学Benoît Ladoux教授，法国索邦大学Bruno Cadot教授，法国克劳德-伯纳德-里昂大学Fabien Le Grand教授和法国索邦大学Léa Trichet教授的团队合作，共同开发了一种具有单细胞水平收缩监测能力的微型三维肌管培养芯片。该微型肌管技术可用于研究肌肉收缩特性并评估疾病如何影响肌肉组织和力的产生。重要的是，它需要的起始材料比目前的系统少得多，这将大大提高药物筛选能力。相关工作在2022年12月13日以“Bioengineering a miniaturized in vitro 3D myotube contraction monitoring chip to model muscular dystrophies”为题发表在《Biomaterials》上。

图1 开发微肌收缩体外系统的方法

为了构建一个具有收缩监测能力的3D肌管培养芯片。研究者在PDMS（聚二甲基硅氧烷）制成的微结构基质上培养从患者活检中扩增的人成肌细胞（图1A）。每个预成型的PDMS芯片为10x10mm（图1B），具有675个图案，每个图案由一对彼此相距150或200µm的微柱构成。在支柱之间，基底的底表面呈现出周期性脊的图案（图1B），以促进微型肌肉纤维的端到端融合和分化，图案的周期性为6µm，每个直线脊高3.5µm，宽3.5µm。这种配置允许在微柱对之间以高密度培养微组织，提供大量复制，同时需要相对较少的成肌细胞进行接种（每个芯片需要10e5个细胞）。考虑了支柱的不同形状、尺寸和高度。根据其几何结构，支柱具有不同的弹簧常数，提供了使系统抵抗弹力适应3D肌管收缩的可能性。

图2 光诱导分子吸附的三维肌管

光诱导分子吸附（LIMA）将PLL-PEG聚合物底物钝化与表面粘附结合，可用于具有浮雕微特征的均匀图案表面，但该技术尚未在骨骼肌3D类器官中实现。研究人员使用LIMA（光诱导分子吸附）技术（图2A）避免整个芯片表面成肌细胞单层形成，限制成肌细胞在柱间区域的粘附。

图3 肌管培养效率的优化

为了促进成肌细胞排列，在成对的微柱之间雕刻了6μm周期性的脊，高度为3.5μm，因为与3μm和12μm的周期性大小相比，这种模式已经显示出产生最健康、排列整齐的成肌细胞。这种修改极大地提高了3D肌管产量（图3）。

图4 成熟三维肌管产生的自发收缩的代表性图像

在微柱上培养的永生化和原代人类成肌细胞的成熟3D肌管，在分化的第7天到第12天之间成功地形成了肌节网络。根据肌管的形状和收缩器的表达标记物，肌节网络以圆柱形的方式向空间扩散。

图5 二维单层和三维肌管内细胞核的形状和尺寸对比

肌肉疾病如椎板疾病会影响肌核结构，在以前的骨骼肌类器官中，也会显示出形状的变化。为了研究三维培养与二维培养相比对细胞核形状的形态学影响，研究人员分析了不同长度尺度下的三维肌管组织，在垂直的z轴上逐片测量每个核的投影面积，以及它们的三维特征。将平均归一化面积（关于最大切片面积-msa）表示为距离核中心的距离的函数，表示了三维形状，更陡的斜率对应于更平坦的核。核切片面积的分布显示，与二维单层膜的核相比，三维肌管内的核的平坦度明显降低。

图6 LMNA基因突变对患者成肌细胞三维肌管收缩活性的影响

为了评估病理结构的功能特征，研究人员监测了来自健康供体（图7A）和L-CMD患者（图7B）的3D肌管收缩活动引起的支柱偏转。与对照组肌管相比，研究人员观察到携带LMNA突变的3D肌管中的支柱偏转更小。与对照组肌管不同，在LMNA突变体肌管中不能观察到自发的抽搐收缩。与失活的3D肌管（用20 μM乙酰胆碱预处理）相比，这些振幅也显著升高。这表明，在LMNA-突变的环境下，这些较低的振幅和相关的较弱的力量与肌细胞融合效率和随后的肌管形成的降低有关。总之，本研究团队设计开发的微肌肉芯片可以准确地测量遗传性肌肉疾病患者的肌肉细胞产生的力的差异。